تكنيك PCR براي اولين بار توسط كري موليس در سال 1983 ابداع شد.PCR  روشي آزمايشگاهي جهت سنتز قطعه مشخصي از DNA است. چون RNA نمي تواند به عنوان الگو در تكنيك PCR مورد استفاده قرار گيرد ,ابتدا توسط آنزيم هاي رونويسي معكوس مانند M-MuLV به DNA تبديل شده و در PCR به كار مي رود. به طور كلي PCR  طي سه مرحله مجزا كه با دما مشخص مي شوند ، انجام مي گيرد .ابتدا DNA الگو تقليب (denature) مي شود تا رشته هاي مكمل جدا شوند.در مرحله بعد واكنش تا رسيدن به يك دماي اتصال (annealing) سرد مي شود تا پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي بتوانند به DNA الگو متصل شوند.طي مرحلهء اتصال ، DNA پلي مراز مقاوم به حرارت فعال بوده و به محض اتصال پرايمرها به DNA الگو ، افزايش طول آنها را آغاز خواهد كرد.نهايتا" واكنش تا رسيدن به دمايي نزديك به دماي بهينه فعاليت آنزيم پلي مراز حرارت داده مي شود. به طور كلي :

٭94 درجه سانتيگراد براي تقليب رشته هاي الگو ، سپس

٭72-40 درجه سانتيگراد (غالبا" شروع با 55 درجه سانتيگراد) براي اتصال پرايمرها ، سپس

٭72 درجه سانتيگراد دماي بهينه براي بسياري از DNAپلي مرازهاي مقاوم به حرارت

٭تكرار سه مرحله بالا براي 40-25 بار ، كه بستگي به كاربردهاي خاص دارد.

٭نهايتا" واكنش تا دماي اتاق يا 4 درجه سانتيگراد سرد مي شود كه بستگي به كاربرد محصول و نوع ترموسايكلر مورد استفاده دارد.(25)

        در حين ساخت DNA ، آنزيم DNA پلي مراز نوكلئوتيد صحيح را براي اضافه كردن پرايمر انتخاب مي كند تا طول زنجيرهء DNA را بر اساس قانون جفت  شدن واتسون – كريك اضافه كند. دو دسته از DNA پلي مرازها بر اساس الگوي مورد استفاده از آنها بكار برده مي شود:

٭DNA پلي مرازهاي وابسته به DNA

٭ِDNA پلي مرازهاي وابسته به RNA كه به نام نسخه بردار معكوس نيز شناخته مي شوند.

     هر DNAپلي مراز همواره ساخت DNA را در جهت 5´ به 3´ انجام مي دهند.بعضي DNAپلي مرازها فعاليت 3´ به 5´ اگزونوكلئازي نيز دارند ، كه فعاليت تصحيح اشتباه (Proof reading)  ناميده مي شود و در واقع بررسي مي كند كه آيا باز صحيح به انتهاي رشتهء DNA در حال ساخت اضافه شده است يا خير. وقتي يك باز اشتباه وارد شود ، خاصيت تصحيح اشتباه ، باز اشتباه را خارج خواهد كرد و سپس فعاليت پلي مرازي مي تواند باز صحيح را وارد كند. اين مكانيسم ، صحت فعاليت پلي مراز را در حين تكثير رشتهء الگو افزايش مي دهد.(25)

.....چندين نوع DNA پلي مرازهاي مقاوم به حرارت وجوددارد : از جمله  DNA پلي مراز Taq ،كه از باكتري گرمادوست Thermus aquaticus اولين بار به وسيلهء Brock و  Freeze شناسايي شد.DNA پلي مراز Taq يك پروتئين 94 KDa است كه دو خاصيت آنزيمي دارد: يكي 5´ به  3´ DNA پلي مراز با پيوستگي 60-50 نوكلئوتيد و ديگري خاصيت 5´ به 3´ اگزونوكلئاز. اين آنزيم نيمه عمر در حدود 40 دقيقه در دماي 95 درجه سانتيگراد دارد ، كه معادل 50 چرخه تحت شرايط عادي PCR مي باشد.آنزيم فوق فعاليت 3´ به5´ اگزونوكلئازي براي تصحيح اشتباه (Proofreading)   ندارند ، به اين معني كه اشتباهات صورت گرفته توسط آنزيم تصحيح نمي شود.و DNA پلي مرازهايي با خاصيت تصحيح اشتباه يا Proofreading هم وجود دارد. مثل : DNAپلي مرازهاي Vent®و Tli و DNAپلي مراز Pfuو DNAپلي مراز  Pwo.(25)

  

محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:

۱٫  DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.و معمولا" 1 نانوگرم يا 1 ماكروليتر در يك واكنش 25 ماكروليتري نياز است.

۲٫  پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNA باشد. 1 ماكروليتربا غلظت 10 پيكومول در يك واكنش  25 ماكروليتري نياز است.

۳٫  Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود ۷۰ درجه سانتیگراد باشد. يك واحد يا 0.5 ماكروليتر در يك واكنش  25 ماكروليتري نياز است.

 

۴٫  دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند. 1ماكروليتربا غلظت 10 ميلي مولار در يك واكنش  25 ماكروليتري نياز است.

 

۵٫  محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.2.5ماكروليتر از بافر 10X  در يك واكنش  25 ماكروليتري نياز است.

 

۶٫  کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز

۷٫  کاتیون یک ظرفیتی: یون پتاسیم

محلولPCR  معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک ۰٫۲ تا ۰٫۵ میلی لیتر تهیه میشود. این لوله ها در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.

در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین ۲۰ تا ۴۰ بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه،  شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود.